基因轉殖動物之技術與應用

動物基因轉殖技術之開發與應用，為國內重點生物科技發展項中之重要項目。期因轉殖動物除可改進家畜生產性能及增強家畜抗病力外，並可作為人類疾病研究、基因調控機制和探討基因功能性之素材。再者將基因轉殖動物作為生產人類所需醫藥產品之生物工廠，藉由其產物如乳汁純化，用以生產高價位之醫藥蛋白，或作為異種器官移植之器官來源等，這些新興科技都將為生技產業開創另一商機。
動物經由遺傳工程技術，透過人為方式，將帶有外源遺傳基因或特定之基因組DNS序列進行刪除或更改之動物，均稱基因轉殖動物。目前將外源基因轉殖動物染色體，以產製基因轉殖動物之方法有數種，包括顯微注射法、反轉錄病毒感染法、胚幹細胞載體法、精子載體法及體細胞核轉置法。其中以顯微注射法係目前最被廣泛應用者，而體細胞核轉置法則是未來最具發展潛力者。

基因轉殖動物產製方法
１、基因顯微注射法(microinjection method)

以原核胚基因顯微注射法，成功產製基因轉殖動物的報告首被發表在１９８０年代；然此法迄今仍被廣泛使用在產製基因轉殖動物，且證實能有效且穩定的獲得基因轉殖動物：對產製基因轉殖之家畜而言，此法可能是最顯著方便之途徑以達成家畜基因轉殖之目的。

顯微注射法的優點為：1.外源DNA在宿主動物染色體上的整合效率為較高，尤其是小鼠整合率可達20~30%；2.由於外源基因之導入會先於雌雄原核融合，故外源基因可以整合到宿主細胞染色體內，且被轉殖之基因，可保有其整套之序列。由此產生的基因轉殖動物所有組織和細胞，包括體細胞和生殖細包，即帶有這一外源基因，且其整合的位置與基因套數(copy number)基本上都一樣，被嵌入之外源基因可正常地在生殖細胞系中被傳承(transmission)給子代；3.不需要載體(即無需病毒複製點和質體)，並能預測轉殖基因表現的方式；4.對導入的基因大小要求不嚴格，甚至可導入50~100kb DNA的片段。

然而，應用顯微注射法亦有缺點，如：1.需具備產生眾多單細胞胚之有效技術；2.顯微操作設備之價格昂貴；3.嫻熟靈巧之顯微注射經驗需較長時間之磨練；4.外源基因注入胚原核後，係以逢機方式嵌入基因組DNA，以基因顯微注射法無法掌握其嵌插情形。此外，顯微操作亦殊為耗時；以豬胚為例，豬胚因含有許多不透明之脂肪物質，需經遠心分離處理，並在顯微鏡下將胚旋轉至適當角度，始可顯露其細胞核，供基因之正確注入，致其顯微操作速度緩慢耗時。

進行顯微注射之較有佳條件有：1.DNA之套數，500~1000 copies/2 pl；2.溶解DNA之緩衝液，TE ( 10 mM Tris HCL, 0.1 mM EDTA, pH 7.5 )；3.DNA之型態，線形且具突起粘端者；4.DNA注射位置，雄原核、或雌原核內；5.所使用的小鼠胚為雜交者。具有純熟之顯微注射與胚移置技術之操作者，若能配合上述條件，進行小鼠之基因顯微注射，其外源基因整合成功之機率可達24~31%。

２、 反轉病毒感染法 (retoviral vector infection method)

應用此法之緣由乃因，反轉錄病毒(retrovirus)具有感染宿主細胞並將其DNA嵌入細胞染色體DNA中之能力。當反轉病毒侵入細胞後，反轉錄病毒的單股RNA鏈即反轉錄為雙股之DNA，進而嵌入基因組DNA中，成為前驅病毒(provirus)，前驅病毒可以整合到宿主染色體中任意位置。本基因轉殖法之主要步驟，係將選殖之基因，先行嵌入一適當之反轉錄病毒載體(如在小鼠中常使用之M-MuLV載體)。

然後再將此等帶有該選殖基因之反轉錄病毒載體，與4~8細胞階段且透明帶已被移除之胚，在體外共同培養16~24小時，俾將外源基因帶入胚之基因組中。本法雖較少應用於哺乳動物，亦仍有轉殖成功的報告。此法之最大優點乃一次可同時處理數目眾多之胚，且祇要實驗室具備反轉錄病毒之經驗者，即可輕易完成試驗，而無需仰賴嫻熟之顯微操作技術。惟其最大缺點則常產生鑲嵌體(mosaic)之後代，且所產生之基因轉殖仔小鼠，可在生殖細胞系中被傳承者較以顯微注射法產製者為低。此外鑒於基因必需被病毒包裝成具有產生感染力之病毒顆粒，因此欲將轉殖基因經由此等病毒帶入胚中，其大小必須被限制在10kb以下。新近，Chan et al.(1998)進一步以體外成熟培養16-17小時之牛卵母細胞，以顯微注射方式將反轉錄病毒顆粒注入卵黃膜間隙，俾進行感染後，再繼續其成熟及受精培養，於體外受精後之早期胚培養結果發現，受精卵中有21%可發育至囊胚期階段，其中10個囊胚分別被移置於5頭受胚牛之子宮中，結果3頭母牛懷孕並順利生下4頭小牛，經分析結果證實4頭小牛均為基因轉殖者，轉殖效率達出生動物之100%，目前亦已經證實可將外源基因傳承至後代，此結果提示，以反轉錄病毒感染方式進行基因轉殖，若將被感染之胚期推進至卵成熟階段，其基因轉殖效率可達出生動物之100%，此為反轉錄病毒法應用於產製大型基因轉殖家畜開啟新的紀元。

３、 胚幹細胞載體法 (embryonic stem cell method)

胚幹細胞(embryonic stem cells, ESC)係源自內細胞群(inner cell mass, ICM)之細胞，經體外株化之ESC或內細胞群細胞團被注入早期囊胚腔後，可與宿主之內細胞群發生嵌合，並參與宿主細胞之分化，並將發育成胚體之各部組織。設若此等注入之胚幹細胞，能成功地參與性腺分化，則可成為生殖細胞系之成員，遂使此等源自胚幹細胞之遺傳物質得以傳承至其後裔之全部組織。

迄今已有多種外源基因轉殖於胚幹細胞之方法可供選擇，包括：1.化學藥劑誘導法-係將外源基因片段以磷酸鈣聚乙二醇誘導或DEAE糊精沉澱之方法引入細胞中；2.生物媒介法-將攜有轉殖基因之脂質體(liposome)及反轉錄病毒分別以融合及轉染(transfection)之方法，將外源基因引入細胞中；3.物理或機械處理法-以顯微注射法與電穿孔法(electroporation)將外源基因嵌入體外培養之胚幹細胞內。經選殖帶有該外源基因之胚幹細胞株後，再藉顯微注射法將之注入囊胚腔中，並使其與囊胚之內細胞群細胞融合，俾產生嵌合胚(chimeric embryos)。經由此等嵌合胚所產生之嵌合體動物，顯然必須經過迴交配種後，方可獲得真正之基因轉殖動物。

應用胚幹細胞融合法進行基因轉殖之基本前提，首需建立有效之胚幹細胞系，且此等幹細胞在生殖細胞系中亦須具有高傳承率。迄今，在小鼠已有許多良好之胚幹細胞系被成功建立，且已用之多年。然而，源自家畜胚之幹細胞，則迄今未被有效建立。雖然新近曾有人將豬胚、牛胚、與綿羊胚之內細胞群細胞自體外予以培養，並根據其細胞形態及分化能力加以研判，指稱其已分別在豬、牛與綿羊等動物之胚，初步分離出某些疑似胚幹細胞之細胞系，惟此等細胞能否真正被用以產生基因轉殖家畜，則有待進一步之試驗。此外，在應用胚幹細胞進行基因定位(gene targetting)或剔除(knock out)時，可將外源基因以同源組合(homologous recombination)之方式植入胚幹細胞之基因組內，再依前述方法注入囊胚腔中；或配合先行育成具組織專一性之Cre-loxP的基因轉殖動物，再將其與該指定位置基因轉殖動物配種，則可用以生產組織專一性基因轉殖及剔除之動物。

４、 精子載體法 (sperm vector method)

本方法係首由義大利科學家Lavitrano et al.(1989)開創成功。氏等在體外先將小鼠精子與外源基因共同培養，令該外源基因之精子相結合後，再以此等帶有外源基因之精子，進行體外受精，將外源基因成功帶入受精卵之基因組中。

氏等甚至宣稱，應用相同技術亦已成功獲得基因轉殖豬之出生，且成功率高達30%；不過令人遺憾的是不少試驗室無法重覆Lavitrano等人的試驗。1997年，Lavitrano et al.再次以精子載體法證實精子可藉由受精作用，將外源之人DAF(decay-accelerating factor)基因傳遞至卵母細胞，且獲得12頭可表現DAF蛋白質之基因轉殖豬。再者，Perry et al.(1999)利用小鼠卵母細胞之細胞質內單一精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術，證實了外源基因可藉由精子頭部作為載體，達基因轉殖之目的；最近，在魚、小鼠、豬和牛亦陸續用精子載體法成功產下基因轉殖子代。應用此方法生產基因轉殖動物，不僅可以免去使用複雜而昂貴的顯微操作設備，且可省略不少繁雜的操作和準備工作。因此，鑒於精子載體法，一旦可穩定重複成功後，其簡便性將遠勝於其他方法者。

５、 體細胞核轉置法 (somatic cell nuclear transfer method)

新近為加速畜群之遺傳改進及提高家畜生產效益，胚之無法增殖(embryo cloning)及基因轉殖技術逐漸受重視。早期複製同源家畜個體之研究偏重於以胚葉細胞(blastomere)當供核者之核轉置技術上，然由之以獲得眾多數目之同源個體仍有其限制。若能使用全能性(totipotency)之細胞株(指胚幹細胞)作為供核者，並移置於受核者之細胞質(尤其源自體外成熟卵母細胞者)後，可獲得大量具有發育成健康個體能力之早期胚，則家畜核轉置技術之應用將更為廣泛。惟迄今源自家畜胚之幹細胞仍未被有效建立，因此擬藉由家畜胚幹細胞作為外源基因之載體，以生產基因轉殖家畜之目標，將倍增困難。為解決此等困境，體細胞核轉置技術之成功開發將是目前唯一可行之路徑。

可喜的，Wilmut et al.(1997)終於利用已分化之成年綿羊的乳腺上皮細胞為供核源，成功產製世界第一頭體細胞核轉置綿羊-桃麗(Dolly)，此結果說明，分化後之細胞核亦可透過人為之處理方式，迫使其被重新被調控至分化前之狀態，同時此創舉也突破了家畜轉置及基因剔除技術之研究瓶頸。體細胞核轉置技術一般除被應用於複製吾人所需之特殊種源動物外，在畜產上也可用以複製相同遺傳背景之高產性能家畜。若進一步配合分子生物學及遺傳工程技術，則可用以生產基因轉殖動物，並有取代基因顯微注射技術及胚幹細胞法生產基因轉殖動物之優勢。

利用體細胞核轉置技術產製基因轉殖動物之成功例證，首由Schnieke et al.(1997)所建立。作者先於體外進行綿羊的胎兒成纖維母細胞之初代培養，再將綿羊β乳球蛋白啟動子(ovine β-lactoglobulin promoter)與人類第九凝血因子(human factor IX)和抗新徽素基因(neomycin resistance gene, Neo)構築而成的融合基因轉染入胎兒成纖維母細胞中，並於體外培養期間以新徽素篩選，於體外即挑選出帶有外源基因的細胞作為供核細胞，配合血清飢餓法調控，進行核轉置動物的產製，結果在五頭出生存活的仔綿羊中，經過基因組DNA分析，證實五隻皆帶有外源基因，基因轉殖的效率達到100%；相較於一九八九年以後，以原核顯微注射法產製基因轉殖羊的效率(4.35%)高出了許多，而證實體細胞核轉置法確有明顯提高基因轉殖效率之能力。以供核體細胞株為載體進行家畜之基因轉殖，可先行於體外進行基因轉殖之細胞篩選，並能有效將產製效率提升為出生動物之100%；目前，已證實體細胞於長時間體外培養後，亦可產製核轉置動物，因此未來將可利用此法進行基因定位及剔除之工作，以助於將基因做最適當的調控；惟在核轉置後，胚之發育潛能仍低，其改善之策略尚有待研究者進一步探討及解決，冀往後複製動物之過程可達例行化之境界。

動物基因轉殖技術之應用
基因轉殖動物除了可提供科學家對特定基因的功能做基礎研究外，亦有許多實際之應用層面：在農業之應用方面，可用以改善畜產動物之生長表現，改善產品的成分，增加特定營養成分、生產抗疾病之畜產動物和作成生物反應器以生產生物藥劑等；在醫學之應用方面，可供解讀基因的功能並獲得新的知識、研究基因對生理系統的調控、建立人類疾病的動物模型，探討人類疾病的致病機轉、製造醫療用的動物產品以及作為異種器官移植(xenotransplantation)之器官捐贈者。

雖然基因轉殖動物之應用層面很廣，且相關之分子生物學、基因工程及基因轉殖技術之研發，均已達純熟之階段，惟目前已被選殖及構築之基因，其調控機制與功能性之瞭解仍佔人類整體基因中之少數。其中具有經濟價值，並可於家畜獲得適當表現，能提高家畜生產性能及抗病力者為數尚少。所幸，近年來動物、植物、甚至人類等之基因組DNA定序工作，均在全球各地陸續展開，並持續解密中。相信待人類及其它生物基因之奧秘被逐漸解開後，將有更多具有經濟價值之標的基因可被應用。

過去的歷史告訴我們，科技的進步雖帶給人類便利且優質的生活，但相對的也帶來負面的影響，因此，當人類在享受動物基因轉殖科技所可能改善人類生活品質之同時，亦應考慮到此項技術所衍生之問題，例如基因轉殖動物之安全管理及其對自然環境的影響、基因轉殖畜產品的安全性及社會大眾的接受程度等，唯有防範未然才擁有永續經營之可能。

文／沈朋志 博士
屏東科技大學畜產系