RNA電泳變性電泳甲醛

本實驗介紹了RNA電泳（即甲醛變性電泳）的原理及操作步驟等。

實驗方法原理
提取樣品的總RNA後，一般根據RNA的凝膠電泳圖來判斷RNA的質量。由於RNA容易形成二級結構，因此常用甲醛變性膠來進行RNA電泳，得到的電泳圖能真實反映RNA的質量狀況。將RNA通過凝膠電泳使之在凝膠中分離出來，通過加入標準核酸分子（markers）對其進行鑑定，並用於轉膜、雜交等。

試劑、試劑盒
1. DEPC 水的處理：用量筒量取去離子水2L，在通風櫥中，加入2ml DEPC到2L去離子水中，終濃度為0.1%的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然後放在搖床中中速搖盪至少4hr，滅菌時再高壓滅菌。

儀器、耗材
1. 電泳設備2. 紫外燈

實驗步驟
1．電泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水沖洗晾乾。
2．鋪膠（40ml） 瓊脂糖0.55g DEPC水36ml 10×MOPS 5ml 37%甲醛9ml 稱0.55克瓊脂糖加36ml DEPC水，微波爐加熱溶解瓊脂糖，肉眼觀察無顆粒狀懸浮物。冷卻至50-60℃，加9ml 甲醛（37%）和5ml 10×電泳緩衝液，然後灌製凝膠，插入合適長度和寬度的梳子，於室溫放置30分鐘以上使凝膠凝固。
3．RNA樣品處理（以一條泳道為例）一般取0.3 g的總RNA，加入1/5體積的5×加樣緩衝液，65℃加熱5 min，冰上驟冷，以消除RNA的二級結構。建議上樣前在RNA樣品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙錠（EB，濃度1.0 mg/mL），而不在膠中加EB，這樣電泳後的背景較低。配好的甲醛變性膠先在1×甲醛變性膠電泳緩衝液中預電泳15min。RNA樣品在5-10 V/cm的電壓降下電泳30min。
4．加2.0ml甲醛凝膠加樣緩衝液（10×）
5．加樣和電泳將凝膠預電泳15min，電壓降為5-10 v/cm。隨後加樣品和標準物，以3-4v/cm電壓降電泳，電泳液為1×MOPS電泳緩衝液。直至溴酚藍遷移至膠下游的3/4處。
6．電泳結束後，在紫外燈下，仔細測量28S rRNA和18S rRNA至加樣孔的距離，並同熒光尺一起拍照，以記錄標準物的位置。

注意事項
1．每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg總RNA進行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（佔mRNA總量的0.1%以上）；如待測RNA含量極微，每個泳道加0.5 -3.0mg poly(A) RNA。
2．標準物28S rRNA≥6333 base；18S rRNA≥2366 base；9S兔b珠蛋白mRNA≥710 base。溴酚藍在前(≥300bp)，二甲苯氰FF在後(≥4kb)。